摘要本文从藻类外源基因转移的载体系统、藻类基因的克隆、藻类的遗传转化三方面详细介绍了藻类

　　基因工程的研究技术及方法,综述了藻类基因工程的研究进展,并对藻类基因工程的前景作了展望。

　　随着陆地资源的开发利用日趋达到极限,世界各国都把注意力集中到了海洋上,期望

　　通过丰富的海洋生物资源来解决日益严重的人口、能源及环境污染的危机。而利用基因工程手段培育优质、高产、抗逆的藻类新品种,开发资源丰富的海藻蛋白,分离生产藻类中

　　具有特殊活性的有用物质,则是使这一目标实现的有效途径。藻类基因工程亦南宫28称藻类遗传工程或藻类重组DNA技术,是以海藻为研究对象将某种

　　生物基因通过基因载体或其他手段运送到海藻活细胞中,并使之增殖(克隆)和行使正常功能(表达),从而创造出藻类新品种的遗传学技术。本文将从藻类外源基因转移的载体系统、藻类基因的克隆、藻类的遗传转化三方面详细介绍藻类基因工程的研究技术及方

　　载体是指携带外源基因并导入到受体细胞中的中间介质,它是影响外源基因表达效果及表达稳定性的重要因素,亦是基因工程的关键所在。藻类基因工程中,除可利用病毒、质粒以及从中派生出的具有各种特点的载体外,还可利用藻类自身的质粒经改造而成为有用载体。目前已在蓝藻、红藻、硅藻中发现了质粒,并利用蓝藻质粒构建成了穿梭载体,红藻和硅藻的相应工作也正在进行中。

　　自从Asato1973年发现蓝藻质粒以来,已在50余株单细胞及丝状蓝藻中证明了质粒

　　的存在,大约是被检测藻株的一半。蓝藻中所含质粒数目1～10不等,分子量在1～80

　　MA1,转化i)x984,发现在其中新合成了两个多肽产物,分别为50kD和43kD,但迄今未找到蓝藻质粒编码功能的证据,均属隐

　　秘型质粒,无从了解它们在生理、生态和进化上的意义。研究表明:不同藻系的不同质粒或同一藻系的不同质粒具有同源序列,推测可能含有与细菌质粒相类似的可转移元件,并

　　迄今构建成的蓝藻质粒载体都是嵌入细菌遗传标记的重组质粒,能在细菌和蓝藻中复制,称为穿梭载体。Hondel等(1980)用含有Tn901(E.coli质粒转座子)和Apr的大肠杆菌质粒pRI46插入SynechococcusPCC7942内源质粒pUH24中,第一次获得了第Apr标记的杂种质粒pCH1及其衍生物pUC1。1981年Kuhlemeier等将pUC1与pACYC184融合,首次获得了“双向质粒”———穿梭质粒pUC104和pUC105,能在E.coli和蓝藻中复制。此后,利用多种单细胞蓝藻质粒与E.coli质粒如pBR322等分别连接,或导入多接头,或补充新的

　　选择标记,改善运载体克隆潜力,又相继构建了许多双向质粒,如pUC29、pUC303、pLS103、

　　运载系统pFCLV7-Synechocystis6803(SUF311)等(见表1),并大大提高了转化效率。为检测外源基因的表达,又相继构建了检测基因表达的质粒,即在穿梭载体中插入报

　　告基因,如荧光素酶基因,氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因β,-半乳糖苷酶(GUS)基因等,以酶的活性显示目的基因的表达和确定启动子的作用。Schmetterer等(1986)构建了含有luc

　　基因的质粒载体pRL305、pRL17a。中科院水生生物研究所徐旭东等(1991)将安装有

　　pUC19的MCS序列的CAT基因重组于穿梭载体pRL25C中,利用CAT基因作为报告基因,

　　构建了鱼腥藻(Anabaena)启动子探测质粒pHB10,可检测外源和内源启动子的表达。

　　同源性 ,与其本身及其它种类红藻中的核 、质体及线粒体基因组均无同源性 ,但目前还难 以确定这种质粒在细胞中的位置 ,对 GL3 . 5 测序后发现含有两个开放阅读框 ,并有转录

　　质粒的发现为红藻遗传分析提供了新的途径 ,将会促进红藻分子遗传学的发展 ,并为红藻

　　克隆的各类已知功能的蓝藻基因达 130 多种 (表 3) ,其中 70 %是编码光合器复合体的 ( 表

　　蓝藻基因克隆与识别主要有 7 种方法 : (1) 利用异源 DNA 探针杂交 ,从基因文库中识 别目的基因 ; (2) 根据已知的氨基酸序列选取最保守的一段 ,人工合成寡核苷酸探针杂交

　　筛选 ; (3) 利用标记抗体从表达基因文库中筛选目的基因 ; ( 4) 标记 RNA 探针与 DNA 杂

　　近两年来又对 30 余种编码功能的藻类基因进行了分离 、克隆 、测序以及表达调控研

　　究 (表 5) 。蓝藻和绿藻中的衣藻已成为基因调控研究的模型 。另外 ,红藻 、硅藻 、隐藻 、金 南宫28藻基因均被克隆 、测序 ,表达调控的研究也正在进行 。其中与光合作用有关的基因 ,研究 的最多 。差减文库技术已用于红藻世代特异表达的分离中 。Liu 等 ( 1994) 建立了紫菜 Porphyra purpurea 配子体和孢子体的 cDNA 文库 ,通过差减杂交法 ,在每个文库中找出了各

　　占总数约 8 %～10 %的与特定发育时期相关的克隆 。进一步在孢子体文库中找到了 8 个 、

　　在配子体文库中找到了 7 个世代特异性表达的 cDNA 序列 ,通过查基因序列库 ,各有两个

　　分子遗传学的各种手段 ,如基因分离 、克隆 、测序 、定位突变 、差减文库等的应用 ,不但 促进了藻类基因工程的发展 ,也带动了藻类光合作用 、起源和进化 、形态发生 、生理生化等

　　藻红蛋白 植烯脱氢酶 脂肪酸脱饱和酶 铁氧还蛋白 延伸因子 EF- G 分歧酶 谷酰胺合成酶

　　伴侣蛋白 伪空胞蛋白 异形胞特异表达基因 磷酸吲哚水解酶 铁调控膜蛋白 插入因子 亮氨酸合成酶 甲硫氨酸合成酶 硝酸还原酶

　　需钙蛋白酶 核酮糖二碳酸羧化酶 DNA 同源重组酶 核糖体大亚基蛋白 核糖体小亚基蛋白 核糖体 RNA 超氧化物歧化酶 可溶性氢酶 硫胺素合成酶 苏氨酸合成酶

　　天然转化 、诱导转化和电击穿孔 。目前发现的能被转化的蓝藻都是无异形胞分化的单细

　　pys ( 八氢蕃茄红素合成酶) pds ( 八氢蕃茄红素脱氢酶) c- 型细胞色素基因

　　nar ( 硝酸盐还原酶 ,位于核基因组) 乙酰辅酶 A 羧化酶基因 ,位于核基因组 ORF217/ 218 ( 位于质粒基因组)